دانلود پایان نامه ارشد : بررسی خصوصیات بیولوژیکی و مولکولی جدایه­ های ایرانی

دانلود پایان نامه

گرایش : بیماری­ شناسی گیاهی

عنوان : بررسی خصوصیات بیولوژیکی و مولکولی جدایه­ های ایرانی 

دانشگاه شهید باهنر کرمان

دانشکده کشاورزی

بخش گیاه پزشکی

 پایان نامه تحصیلی جهت دریافت درجه کارشناسی ارشد بیماری­ شناسی گیاهی

بررسی خصوصیات بیولوژیکی و مولکولی جدایه­ های ایرانی ویروس بی بذری گوجه فرنگی (TAV) از گیاهان زینتی

 استاد راهنما:

دکتر حسین معصومی

 اساتید مشاور:

دکتر جهانگیر حیدرنژاد

دکتر اکبر حسینی پور

برای رعایت حریم خصوصی نام نگارنده پایان نامه درج نمی شود

(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)

تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :

(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)

چکیده

       ویروس بی­بذری گوجه فرنگیTAV)) از خانواده بروموویریده و جنس کوکوموویروس بوده که از اکثر نقاط دنیا گزارش گردیده و در میزبان­های متعددی ایجاد بیماری می­کند. ژنوم ویروس متشکل از سه قطعه آر.ان.ای تک رشته­ای مثبت می باشد که پروتئین­های متفاوتی را کد می­نماید. در این تحقیق به منظور شناسایی و معرفی ویروس TAV ازایران، طی سال­های ۸۸ الی۹۰ تعداد ۴۱۳ نمونه گیاهی از استان­های کرمان، همدان، آذربایجان­غربی، آذربایجان­شرقی، فارس و یزد جمع آوری و جهت تأئید آلودگی نمونه ها از آزمون DAS-ELISA استفاده گردید. نتایج حاصل از این آزمون بیانگر شناسایی و وجود ویروس بی­بذری گوجه فرنگی از روی گیاهان اطلسی و داوودی در کشور بود. با توجه به اینکه ویروس TAV برای نخستین بار در ایران شناسایی می­گردد، لذا جدایه اطلسی (Ker.Mah.P) ویروس ردیابی شده از منطقه ماهان استان کرمان به منظور مطالعات مولکولی و تکثیر طول کامل ژنوم و جدایه داوودی (Ker.Ker.Ch.1) نیز جهت تکثیر ژن پروتئین پوششی و به دنبال آن تعیین جایگاه تکاملی آنها و مطالعات بیولوژیکی مورد بررسی قرار گرفتند. جهت تعیین دامنه میزبانی جدایه های ایرانی TAV از ۳۴ گونه گیاهی از۷ خانواده استفاده گردید که نتایج حاصل بیانگر دامنه میزبانی گسترده جدایه­های ایرانی TAV می باشد. طول کامل ژنوم جدایه ایرانی Ker.Mah.P و ژن CP جدایه Ker.Ker.Ch.1 نیز با استفاده از آغازگرهای اختصاصی با روش RT-PCR تکثیر و سپس همسانه سازی و تعیین ترادف گردیدند. بر­اساس نتایج بدست آمده طول قطعات RNA-1، RNA-2 و RNA-3 جدایه ایرانی Ker.Mah.P به ترتیب ۳۳۵۱، ۳۰۰۸ و ۲۱۹۲ نوکلئوتید تعیین گردید و در نهایت طول کامل ژنوم این جدایه معادل ۸۵۵۱ نوکلئوتید می باشد. همچنین نتایج حاصل از تجزیه فیلوژنتیکی براساس ناحیه ژنی CP بیانگر آن است که جدایه­های TAV در دو گروه اصلی I و II قرار می گیرند. گروه I نیز به دو زیر گروه IIA و IIB تقسیم می­گردد که هر دو جدایه ایرانی TAV در زیر گروه IIA به همراه جدایه­های گزارش شده از کشورهای مختلف دنیا واقع می­گردند. همچنین جدایه­های ایرانی دارای میزان مشابهت بالای ترادف نوکلئوتیدی و اسیدهای­آمینه مربوط به ژن پروتئین پوششی به میزان بیش از ۹۹ درصد با یکدیگر می­باشند. نتایج حاصل از این تحقیق بیانگر آن است که ترادف نوکلئوتیدی جدایه­های ایرانی TAV، علی رغم وجود این جدایه­ها در یک منطقه جغرافیایی جدید و میزبان متفاوت (گیاه اطلسی)، شبیه دیگر جدایه­های گزارش  شده این ویروس به شدت حفاظت شده می­باشند. همچنین گیاه اطلسی برای نخستین بار در دنیا به عنوان میزبان طبیعی ویروس TAV شناسایی و گزارش می­گردد.

کلمات کلیدی: ویروس بی­بذری گوجه فرنگی، ژنوم کامل، ترادف نوکلئوتیدی، دامنه میزبانی، اطلسی

فهرست مطالب
فصل اول: مقدمه
۱ ۱-۱- معرفی ویروس بی بذزی گوجه فرنگی
۱ ۱-۲- بررسی دامنه میزبان­های طبیعی و علائم ویروس بی بذری گوجه فرنگی
۲ ۱-۲-۱- میز بان­های اولیه
۲ ۱-۲-۱-۱-گل داوودی
۲ ۱-۲-۱-۱-۱- علائم ویروس بی بذزی گوجه فرنگی بر روی گیاه داوودی
۳ ۱-۲-۱-۱-۲- دیگر ویروس های داوودی
۳ ۱-۲-۱-۲- گیاه گوجه فرنگی
۳ ۱-۲-۱-۲-۱- علائم ویروس بی بذری گوجه فرنگی بر روی گیاه گوجه فرنگی
۴ ۱-۲-۱-۲-۲- دیگر ویروس های گوجه فرنگی
۴ ۱-۲-۲- میزبان های ثانویه ویروس بی­بذری گوجه فرنگی
۴ ۱-۲-۲-۱- خانواده Compositae
۴ ۱-۲-۲-۱-۱-گل آهار
۴ ۱-۲-۲-۲- خانواده Solanaceae
۴ ۱-۲-۲-۲-۱-گیاه فلفل
۵ ۱-۲-۲-۳- خانواده Iridaceae
۵ ۱-۲-۲-۳-۱- گل گلایول
۵ -۲-۲-۳-۲- گل سنبل
۶ ۱-۲-۲-۴- خانواده Tropaeolaceae
۶ ۱-۲-۲-۴-۱- گل لادن
۶ ۱-۲-۲-۵- خانواده Cannaceae
۶ ۱-۲-۲-۵-۱- گل اختر
۷ ۱-۲-۲-۶- خانواده Liliaceae
۷ ۱-۲-۲-۶-۱- گل سوسن
۷ ۱-۲-۲-۷- خانواده Lamiaceae
۷ ۱-۲-۲-۷-۱- گیاه نعناع
۷ ۱-۲-۲-۸- خانواده Leguminosae
۷ ۱-۲-۲-۸-۱- گیاه لوبیا
۸ ۱-۲-۲-۹- خانواده Chenopodiaceae
۸ ۱-۲-۲-۹-۱- گیاه اسفناج
۸ ۱-۲-۲-۱۰- خانواده Campanulaceae
۸ ۱-۲-۲-۳-۱۰- گل استکانی
۹ ۱-۳- اهداف تحقیق
فصل دوم: مروری برمنابع
۱۰ ۲-۱- جایگاه ویروس بی بذری گوجه فرنگی در طبقه بندی ویروس­های گیاهی
۱۰ ۲-۲- جنس کوکوموویروس
۱۰ ۲-۲-۱- ویژگی های ویریون
۱۱ ۲-۲-۲- ویژگی های ژنو
۱۲ ۲-۲-۳- عملکرد پروتئین ها در جنس کوکوموویروس
۱۲ ۲-۲-۳-۱- پروتئین ۱a
۱۲ ۲-۲-۳-۲- پروتئین ۲a
۱۳ ۲-۲-۳-۳- پروتئین ۲b
۱۴ ۲-۲-۳-۴- پروتئین ۳a
۱۴ ۲-۲-۳-۵- پروتئین پوششی (CP)
۱۵ ۲-۳- ویروس بی­بذری گوجه فرنگی در جهان
۱۶ ۲-۳-۱- سازماندهی ژنوم ویروس بی­بذری گوجه فرنگی
۱۶ ۲-۳-۲- آر.ان.ای­های ژنومی
۱۶ ۲-۳-۲-۱- قطعه RNA-1
۱۷ ۲-۳-۲-۲- قطعه RNA-2
۱۸ ۲-۳-۲-۳- قطعه RNA-3
۱۸ ۲-۳-۳- آر.ان.ای­های زیر­ژنومی
۱۹ ۲-۴- دامنه میزبانی و علائم ویروس بی­بذری گوجه فرنگی
۱۹ ۲-۴-۱- دامنه میزبانی ویروس بی­بذری گوجه فرنگی بر روی گیاهان آزمون
۱۹ ۲-۴-۲- گیاهان تشخیصی ویروس ویروس بی­بذری گوجه فرنگی
۲۰ ۲-۴-۳-گیاهان تکثیری ویروس بی­بذری گوجه فرنگی
۲۰ ۲-۵- تفاوت­های ویروس بی­بذری گوجه فرنگی و ویروس موزائیک خیار
۲۱ ۲-۶ – روش­های انتقال ویروس بی­بذری گوجه فرنگی
۲۱ ۲-۶-۱- انتقال با حشره ناقل
۲۱ ۲-۶-۲- انتقال با بذر
۲۱ ۲-۶-۳- انتقال با سس
۲۱ ۲-۷- سرولوژی
۲۲ ۲-۸- ویژگی های فیزیکی و فیزیوشیمیایی
۲۲ ۲-۹- مکانیزم ایجاد بی بذری توسط ویروس بی­بذری گوجه فرنگی
۲۳ ۲-۱۰- زیان های اقتصادی توسط ویروس بی­بذری گوجه فرنگی
۲۳ ۲-۱۱- نقش پروتئین حرکتی ویروس بی­بذری گوجه فرنگی در بروز علائم
۲۴ ۲-۱۲- نقش پروتئین پوششی ویروس بی­بذری گوجه فرنگی در ایجاد آلودگی سیستمیک در گیاه
۲۵ ۲-۱۳- هیستولوژی
فصل سوم: مواد و روش­ها
۲۶ ۳-۱- نمونه برداری
۲۶ ۳-۲- آزمون الایزا
۲۶ ۳-۲-۱- مراحل الایزای ساندویچ دو طرفه
۲۷ ۳-۲-۲- بافرهای مورد استفاده در آزمون های الایزا
۲۹ ۳-۳- تعیین دامنه میزبانی ویروس بی­بذری گوجه فرنگی و مطالعات گلخانه ای
۲۹ ۳-۳-۱- بافر فسفات ۱/۰ مولار ۷ pH=
۳۰ ۳-۴- مطالعات مولکولی
۳۰ ۳-۴ -۱- استخراج Total RNA با استفاده از کیت High pure viral nucleic acid kit
۳۱ ۳-۴-۲- آزمون واکنش زنجیره ای پلیمراز به روش نسخه برداری معکوس
۳۱ ۳-۴-۲-۱- مرحله سنتز cDNA
۳۲ ۳-۴-۲-۲- مراحل آزمون PCR
۳۲ ۳-۴-۳- آغازگرهای اختصاصی مورد استفاده جهت تکثیر ژنوم جدایه ایرانی ویروس بی­بذری گوجه فرنگی
۳۲ ۳-۴-۴- الکتروفورزافقی
۳۳ ۳-۴-۴-۱- مواد لازم جهت تهیه بافر TBE
۳۳ ۳-۴-۴-۲- آماده سازی نشانگر مولکولی
۳۳ ۳-۵- همسانه سازی و تعیین توالی قطعات مختلف ژنوم جدایه ایرانی ویروس بی­بذری گوجه فرنگی مجزا شده از گیاه اطلسی (Ker.Mah.P) و ژن پروتئین پوششی جدایه مجزا شده از گیاه داوودی (Ker.Ker.Ch.1)
۳۴ ۳-۵-۱- قراردادن قطعه DNA موردنظر درون ناقل (Ligation)
۳۴ ۳-۵-۱-۱- خالص سازی محصول پی.سی.آر با استفاده از کیت (High Pure PCR Product Purification Kit)
۳۴ ۳-۵-۱-۲- استخراج از ژل با استفاده از کیت Agarose Gel DNA Extraction Kit
۳۵ ۳-۵-۲- مراحل آماده سازی باکتری جهت عمل ترنسفورماسیون (Transformation)
۳۵ ۳-۵-۲-۱- کشت باکتری Escherichia coli بر روی محیط کشت جامد (Luria Bertani)  LB
۳۶ ۳-۵-۲-۲-کشت باکتری E.coli در محیط مایع C-medium
۳۶ ۳-۵-۲-۳- تهیه سلول های مستعد (competent cell) باکتری E.coli
۳۷ ۳-۵-۳- انتقال پلاسمید نوترکیب به درون باکتری E.coli (Transformation)
۳۷ ۳-۵-۴- محیط کشت جامد حاوی آمپی سیلین، IPTG و X-gal
۳۸ ۳-۵-۵- انتخاب پرگنه جهت استخراج پلاسمید نوترکیب
۳۸ ۳-۵-۶- استخراج پلاسمید نوترکیب از باکتری توسط روش Boiling:
۳۹ ۳-۵-۷- استخراج پلاسمید نوترکیب از باکتری توسط High Pure Plasmid Isolation Kit,
۴۰ ۳-۵-۷-۱- مواد تشکیل دهنده بافرهای استفاده شده در استخراج پلاسمید
۴۰ ۳-۵-۸- هضم آنزیمی پلاسمید (Digestion)
۴۱ ۳-۵-۹- انجام الکتروفورز جهت بررسی صحت انجام عمل هضم آنزیمی پلاسمید و همسانه سازی
۴۱ ۳-۶- نگهداری باکتری حاوی پلاسمید نوترکیب
۴۱ ۳-۷- آماده سازی نمونه ها به منظورتعیین توالی نوکلئوتیدی
۴۱ ۳-۸- تعیین ترادف ژنوم کامل جدایه ایرانی ویروس بی­بذری گوجه فرنگی مجزا شده از گیاه اطلسی (Ker.Mah.P) و ژن پروتئین پوششی جدایه مجزا شده از گیاه داوودی (Ker.Ker.Ch.1) و مقایسه آن­ها با سایر جدایه های موجود در بانک ژن
فصل چهارم: نتایج
۴۳ ۴-۱- شناسایی و معرفی ویروس بی بذری گوجه فرنگی در ایران
۴۳ ۴-۱-۱- علائم جدایه های شناسایی شده
۴۳ ۴-۱-۱-۱- جدایه اطلسی (Ker.Mah.P)
۴۳ ۴-۱-۱-۲- جدایه داوودی (Ker.Ker.Ch.1)
۴۴ ۴-۲- تعیین دامنه میزبانی جدایه­های ایرانی ویروس بی­بذری گوجه فرنگی
۴۴ ۴-۲-۱- بررسی علایم ایجاد شده بر روی گیاهان مایه زنی شده خانواده Solanaceae
۴۴ ۴-۲-۱-۱- علائم ایجاد شده بر روی میزبان های طبیعی ویروس بی­بذری گوجه فرنگی
۴۴ ۴-۲-۱-۱-۱-گیاه گوجه فرنگی
۴۴ ۴-۲-۱-۱-۲- گیاه فلفل
۴۵ ۴-۲-۱-۱-۳- گل اطلسی
۴۵ ۴-۲-۱-۲- علائم بر روی میزبان های آزمایشگاهی ویروس در خانواده Solanaceae
۴۵ ۴-۲-۱-۲-۱- گیاه توتون Nicotiana glutinosa L.
۴۵ ۴-۲-۱-۲-۲- گیاه توتون Nicotiana Clevelendii Gray.
۴۶ ۴-۲-۱-۲-۳- گیاه توتون Nicotiana tabacum L. cv. Whiteburly
۴۶ ۴-۲-۱-۲-۴- گیاه توتون Nicotiana debneyii L.
۴۶ ۴-۲-۱-۲-۵- گیاه توتون Nicotiana tabacum var Samsun NN.  
۴۶ ۴-۲-۱-۲-۶- گیاه توتون Nicotiana tabacum L. cv. Turkish
۴۶ ۴-۲-۱-۲-۷- گیاه داتوره.Datura maxima L
۴۷ ۴-۲-۱-۲-۸-گیاه داتوره.Datura stramonium L
۴۷ ۴-۲-۲- بررسی علایم ایجاد شده بر روی گیاهان مایه زنی شده خانواده Compositaeae
۴۷ ۴-۲-۲-۱- گل داوودی
۴۷ ۴-۲-۲-۲- گل آهار
۴۸ ۴-۲-۲-۳- گل آفتابگردان زینتی
۴۸ ۴-۲-۳- بررسی علایم ایجاد شده بر روی گیاهان مایه زنی شده خانواده Chenopodiaceae
۴۸ ۴-۲-۳-۱- گونه­های کنوپودییوم
۴۸ ۴-۲-۳-۲- گیاه اسفناج
۴۸ ۴-۲-۴- بررسی علایم ایجاد شده بر روی گیاهان مایه زنی شده خانواده Cucurbitaceae
۴۹ ۴-۲-۴-۱- گیاه خیار رقم Peto Seed
۴۹ ۴-۲-۵- بررسی علایم ایجاد شده بر روی گیاهان مایه زنی شده خانواده Leguminosae
۴۹ ۴-۲-۵-۱- گیاه لوبیا چشم بلبلی رقم مشهد
۴۹ ۴-۲-۵-۲- گیاه لوبیا سبز رقم Sunrise
۴۹ ۴-۳- استخراج Total RNA و آزمون RT-PCR
۵۰ ۴-۴- همسانه سازی قطعات تکثیر شده ژنوم جدایه های ایرانی ویروس بی بذری گوجه فرنگی
۵۱ ۴-۵- تعیین ترادف طول کامل ژنوم جدایه Ker.Mah.P و تعیین جایگاه تکاملی جدایه­های ایرانی ویروس بی­ بذری گوجه فرنگی
فصل پنجم: بحث
۵۲ ۵-۱- بحث
۶۰ منابع مورد استفاده

– معرفی ویروس بی بذزی گوجه فرنگی

      ویروس بی بذری گوجه فرنگی[۱] ویروسی است از خانواده بروموویریده[۲] و جنس کوکوموویروس[۳] که برای نخستین بار در سال ۱۹۳۹ توسط Ainsworth از روی گیاه داوودی و در سال ۱۹۴۹ از روی گیاه گوجه فرنگی توسط Blencowe و Caldwell گزارش گردید. ویروس بی بذری گوجه فرنگی گسترش جهانی داشته و در کشت­های داوودی ایجاد آلودگی نموده در حالیکه در کشت های گوجه فرنگی کمتر یافت می گردد (Hollings & Stone, 1970). پیکره­ها­ی TAV ایزومتریک به قطر حدودا ۳۰ ن